動物細胞的特點及生長特性:
動物細胞雖可像微生物細胞一樣, 在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng), 但其細胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細胞相比, 有顯著差別 :①動物細胞比微生物細胞大得多, 無細胞壁, 機械強度低, 對剪切力敏感, 適應(yīng)環(huán)境能力差; ②倍增時間長, 生長緩慢, 易受微生物污染, 培養(yǎng)時須用抗生素; ③培養(yǎng)過程需氧量少（氧傳質(zhì)系數(shù)kLa 大于10 h - 1即可滿足每毫升107 個細胞的生長） ; ④培養(yǎng)過程中細胞相互粘連以集群形式存在; ⑤原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性, 生產(chǎn)成.本高, 但附加值也高。
一. 固定化動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)
1. 固定化培養(yǎng)方法
在動物細胞培養(yǎng)中, 培養(yǎng)細胞的目的不僅僅要求催化活細胞培養(yǎng)中, 培養(yǎng)細胞的目的不僅僅要求催化活力, 更重要的是利用細胞來合成和分泌蛋白, 因此如何保持細胞的活性顯得尤為重要。由于動物細胞的極度敏感性, 上述這些固定化方法會對動物細胞產(chǎn)生毒性, 另外多糖（如卡拉膠等） 由于具有很高的離子強度也會對細胞產(chǎn)生毒害。故在動物細胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法, 如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。
1. 1 吸附
1. 1. 1 多孔陶瓷
美國某公司開發(fā)了一種*自動化的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應(yīng)器。反應(yīng)器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長表面積。既可用于培養(yǎng)懸浮生長的細胞,又可用于培養(yǎng)貼壁依賴性細胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中, 給分離純化帶來方便。而且細胞不用從培養(yǎng)基中分離, 所以不必考慮梯度問題; 當(dāng)培養(yǎng)基高速循環(huán)時, 可以保持相對恒定的營養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實現(xiàn)放大.
1. 1. 2 微載體
微載體細胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒（微載體） , 使細胞在微載體表面附著和生長, 并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面, 1 g 微載體其比表面積可達6 000 cm2 , 從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。
微載體的直徑在60～250μm , 由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性, 在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì), 因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點: ①比表面積大, 單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高; ②采用均勻懸浮養(yǎng), 無營養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度; ③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況; ④細胞收獲過程相對簡單, 勞動強度小; ⑤培養(yǎng)基利用率高, 占地面積小; ⑥放大容易, 國外已有公司以1 000 L 規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細胞來生產(chǎn)β- 干擾素。但其缺點是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細胞; 接種密度高; 微載體吸附力弱, 不適合培養(yǎng)懸浮型細胞。
1. 1. 3 大孔微載體
人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞易受機械損傷的缺陷以及能zui大限度地擴大比表面積, 開發(fā)了具有*連通溝回的大孔微載體。
大孔微載體將細胞固定在孔內(nèi)生長, 因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點: ①比表面積大,是實心微載體的幾倍甚至幾十倍; ②細胞在孔內(nèi)生長, 受到保護, 剪切損傷小; ③與包埋法相比, 傳質(zhì)尤其是傳氧效果好 ; ④兩種類型細胞都適用;⑤細胞三維生長, 細胞密度是實心微載體的10 倍以上, 有的可達108 個/ mL; ⑥適用于長期維持培養(yǎng),細胞生長情況依然良好; ⑦微載體濃度高, 實心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時, 細胞密度反而下降; 而大孔微載體在濃度較高時, 表面碰撞增加, 能促使細胞在孔內(nèi)生長; ⑧于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言, 大孔微載體質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言, 大孔微載體技術(shù)將成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。
1. 2 包埋
將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便, 條件溫和, 負荷量大, 細胞泄露少。因細胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護, 細胞能抗機械剪切。但該法也有一定缺點, 如擴散限制, 并非所有細胞都處于*營養(yǎng)物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細胞的固定化。多孔凝膠是zui常用的載體, 用于動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。
1. 2. 1 海藻酸鈣凝膠
海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻, 然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1 mm 內(nèi)含動物細胞的海藻酸鈣膠珠, 分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時條件溫和, 對活細胞損傷小。但固定后機械強度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細胞, 國外已有專門的振動噴嘴設(shè)備可供使用。
1. 2. 2 瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中（如石蠟油） , 形成直徑0. 2 mm 凝膠珠珠, 移去石蠟油后, 細胞即可進行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣, 瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細胞。盡管凝膠珠形成過程很復(fù)雜, 目前放大體積不超過20 L 。但瓊脂糖凝膠無毒性, 具有較大的空隙, 可以允許大分子物質(zhì)自由擴散, 因此該法特別適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細胞和淋巴細胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細胞介素 。
1. 2. 3 血纖維蛋白
將動物細胞與血纖維蛋白原混合, 然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白, 將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁, 因此兩種類型的細胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔, 允許大分子物質(zhì)的自由擴散。但機械強度差, 對剪切力很敏感。
1. 3 中空纖維
中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài), 利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養(yǎng)的細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。典型的封閉中空纖維如下圖：
封閉式中空纖維反應(yīng)器循環(huán)系統(tǒng)示意圖
中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是無剪切、高傳質(zhì)、營養(yǎng)成分的選擇性滲入, 使培養(yǎng)細胞和產(chǎn)物密度都可達到比較高的水平。缺點是膜的污染和堵塞, 觀察困難, 細胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間生長, 以達到更高的細胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應(yīng)器已進入工業(yè)化生產(chǎn), 主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞來生產(chǎn)單克隆抗體.
1. 4 微囊化
微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點是: 在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)。生長介質(zhì)為1. 4 %海藻酸鈉溶液, 半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)。實驗證明, 采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體, 在7～27 d微囊內(nèi)抗體濃度可達1 250～5 300 mg/ L 。利用微囊包裹具有特定功能的組織細胞, 形成免疫隔離的人工細胞, 以此植入疾病動物或病人體內(nèi)。1980 年報道了微囊化胰島移植治療大量實驗性糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸- 聚賴氨酸- 聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi), 在未用免疫抑制劑的情況下, 控制大鼠血糖正常達一年左右。
膠囊化培養(yǎng)的優(yōu)點是: ①可防止細胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷; ②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜, 從而提高細胞密度和產(chǎn)物含量, 并方便分離純化處理。缺點是: ①微囊制作復(fù)雜, 成功率不高; ②微囊內(nèi)死亡的細胞會污染正常產(chǎn)物; ③收集產(chǎn)物必須破壁, 不能實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。
2. 固定化方法的選擇
（1） 培養(yǎng)規(guī)模。由于各種固定化系統(tǒng)可以獲得相同的細胞密度, 且細胞的產(chǎn)率主要取決于細胞的擴散, 因此反應(yīng)器的體積是培養(yǎng)規(guī)模放大的主要決定因素。雖然微載體系統(tǒng)可以提供zui大的單元操作,但其他系統(tǒng)也可以通過增加單元套數(shù)而獲得放大。
（2） 培養(yǎng)方式。除了海藻酸鈣包埋法外, 其他固定化基質(zhì)都是多孔型的, 能允許大分子物質(zhì)自由出入, 因此可實現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產(chǎn)物積聚到很高的濃度, 給后續(xù)的分離純化處理帶來方便, 并大大降低了生產(chǎn)成本。
（3） 所培養(yǎng)的細胞類型。大多數(shù)固定化系統(tǒng)都適用于貼壁型細胞的培養(yǎng)。而在吸附非貼壁型細胞時, 由于吸附力弱容易出現(xiàn)細胞泄露。
（4） 制備方法的難易和成本。由于固定化基質(zhì)是由制造商在不同的競爭時期提供的, 因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學(xué)試劑形式出售; 膠原珠是以無菌形式提供給使用者, 以便于接種。
3. 存在問題
（1） 固定化細胞培養(yǎng)的細胞密度較一般懸浮培養(yǎng)高10～100 倍, 但同時也帶來了如何保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞問題。
（2） 細胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問題 。包埋在凝膠或微囊中死亡的細胞會對其他細胞產(chǎn)生污染和毒害作用。
（3） 培養(yǎng)基及固定化基質(zhì)價格昂貴, 生產(chǎn)成本高居不下。尤其是的微載體細胞培養(yǎng)介質(zhì), 銷售價格一直呈上漲趨勢。
（4） 目前對細胞代謝和生長動力學(xué)的研究以及在線監(jiān)測水平還遠不足以設(shè)計出確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng), 從而導(dǎo)致昂貴培養(yǎng)基的浪費。
4. 固定化動物細胞培養(yǎng)的展望
固定化動物細胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是大型化、自動化、精巧化、低成本、高細胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。從上的發(fā)展趨勢看, 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)主要有: （1） 開發(fā)細胞培養(yǎng)反應(yīng)器和培養(yǎng)系統(tǒng); （2） 開發(fā)培養(yǎng)貼壁細胞的載體; （3） 開發(fā)微囊技術(shù); （4） 開發(fā)雜交、重組技術(shù); （5） 開發(fā)無血清和化學(xué)合成的培養(yǎng)基; （6） 蛋白質(zhì)濃縮和提純技術(shù)。
二．動物細胞的灌注養(yǎng)方法
動物細胞培養(yǎng)同傳統(tǒng)的微生物細胞培養(yǎng)相比, 動物細胞培養(yǎng)存在著細胞倍增時間長、代謝途徑復(fù)雜、對營養(yǎng)的要求高、對外界環(huán)境如溫度、pH、溶氧、滲透壓、剪切力的敏感性強、細胞狀態(tài)容易改變等問題, 大大增加了動物細胞培養(yǎng)的難度。如何完善細胞培養(yǎng)技術(shù), 提高動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)率, 一直是國內(nèi)外研究的熱點之一。
1 灌注培養(yǎng)
常用的動物細胞培養(yǎng)方法有分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng), 但產(chǎn)率一直不高。直到六十年代, 灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn), 為動物細胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)開辟了廣闊的前景。在隨后的三十年中, 灌注培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速地發(fā)展, 已成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。
在灌注培養(yǎng)中, 細胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中, 收獲培養(yǎng)液的同時不斷地加入新鮮的培養(yǎng)基。灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分, 并可帶走代謝產(chǎn)物, 同時, 細胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中,可以達到很高的細胞密度。同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個數(shù)量級, 并可大大降低勞動力消耗。
灌注培養(yǎng)主要可分為兩大類: 懸浮灌注培養(yǎng)和床層培養(yǎng)（圖1）。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上, 加上一個細胞分離器而成, 以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉(zhuǎn)過濾分離器zui為常見。床層培養(yǎng)則把細胞直接保留于床層, 不需要細胞分離器, 其中堆積床和大孔載體培養(yǎng)的應(yīng)用較廣。
2 灌注培養(yǎng)方法
在灌注培養(yǎng)前, 對動物細胞的生長和生理特性進行充分的考察, 是十分必要的, 能為灌注培養(yǎng)提供有益的參考。以比生長速率為例, 大量實驗表明, 細胞的比生長速率降低時, 產(chǎn)物的比生長速率提高，有人控制細胞的比生長速率為zui大比生長速率的60%抗體生長速率增加了97%。 灌注培養(yǎng)可以從兩個方面入手, 一是改變動物細胞的培養(yǎng)環(huán)境, 實行階段培養(yǎng); 二是進行代謝調(diào)控。
灌注培養(yǎng)分類圖
2. 1 階段培養(yǎng)
一般認為, 動物細胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實際上, 每種細胞的zui適生長條件和zui適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點, 把培養(yǎng)過程分為細胞生長期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達到在細胞生長期使接種細胞大量繁殖, 提高比生長速率, 盡快獲得高密度細胞; 在產(chǎn)物生成期保持細的高密度, 維持存活率, 降低細胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對細胞有抑制時, 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢。具體說來, 可以用以下方法。
2. 1 階段培養(yǎng)
一般認為, 動物細胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實際上, 每種細胞的zui適生長條件和zui適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點, 把培養(yǎng)過程分為細胞生長期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達到在細胞生長期使接種細胞大量繁殖, 提高比生長速率, 盡快獲得高密度細胞; 在產(chǎn)物生成期保持細的高密度, 維持存活率, 降低細胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對細胞有抑制時, 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢。具體說來, 可以用以下方法。
2. 1. 2 pH 值階段培養(yǎng)
對大多數(shù)動物細胞, 培養(yǎng)液中合適的pH為7. 2—7. 4。低于6. 8 或高于7. 6 對細胞的生長都不利。近年來, 對胞內(nèi)pH 的研究比較活躍。實驗發(fā)現(xiàn) 胞內(nèi)pH 對細胞的代謝影響很大, 胞內(nèi)pH 降低0. 2 個單位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途徑, 使細胞的生長受阻; 而胞內(nèi)pH 升高0. 2 個單位,可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培養(yǎng)液中銨離子濃度的提高, 都能引起胞漿酸化, 胞內(nèi)pH 降低。有人把CO 2 的濃度由5% 降為2. 5% ,胞內(nèi)pH 提高了0. 2 個單位。胞內(nèi)pH 比胞外pH 的檢測麻煩 , 所以還沒有廣泛應(yīng)用。
2. 1. 3 溶氧階段培養(yǎng)
不同細胞和同一細胞在不同生長時期對氧的需求均不相同.有人 發(fā)現(xiàn)細胞生長的zui適溶氧值為60% , 但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的zui適溶氧為100%。一般說來, 溶氧主要影響細胞的繁殖, 而對產(chǎn)物的生成無直接影響, 通過影響細胞生長間接起作用。通常在細胞生長初期控制溶氧的較低的水平, 在對數(shù)生長期, 當(dāng)細胞達到較高的濃度時, 提高溶氧水平; 在產(chǎn)物生成期, 應(yīng)控制溶氧的適當(dāng)水平。溶氧過高, 細胞就會加速消耗營養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物對細胞有抑制作用, 會大大降低細胞的存活率, 降低產(chǎn)物的比生成速率。溶氧過低, 細胞過氧的需求得不到滿足, 依然會降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)率。
2. 1. 4 化學(xué)試劑誘導(dǎo)階段培養(yǎng)
如果構(gòu)建的細胞上有可誘導(dǎo)基因, 進入產(chǎn)物生成期后, 就可以添加化學(xué)試劑對基因進行誘導(dǎo), 以實現(xiàn)目的基因的高表達, 比如,將表達尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體, 分別受金屬硫（M T ） 和SV 40 早期啟動子控制, 具有用氨甲喋呤（M TX） 使基因擴增和利用金屬Zn2+ 誘導(dǎo)的雙重功能, 有利于尿激酶的高表達。
細胞在細胞周期的不同時期, 不僅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制細胞的生理狀態(tài)很重要。然而, 在細胞培養(yǎng)中, 細胞生理狀態(tài)的檢測很麻煩。有人發(fā)現(xiàn),細胞大小隨各時期變化很明顯, 因此可以作電子細胞計數(shù)器就行了。分段培養(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進行。有些細胞的zui適生長溫度和產(chǎn)物生成溫度相同, 就不能進行溫度階段培養(yǎng), 而應(yīng)尋找別的差異條件。在細胞生長期有的細胞可能會因比生長速率過大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細胞, 這時就應(yīng)控制比生長速率在一個適當(dāng)?shù)姆秶?/p>
3 代謝調(diào)控培養(yǎng)
乳酸和氨是在培養(yǎng)過程中動物細胞產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物 , 對細胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)中的這一問題尤為突出。盡管灌注培養(yǎng)可以通過提高灌注速度來去除抑制產(chǎn)物。但是, 一方面由于灌注培養(yǎng)細胞濃度很高, 提高灌注速率, 營養(yǎng)成分的供給十分充分, 氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。另一方面, 過高的灌注速率提高了細胞的比生長速率, 降低產(chǎn)物的比產(chǎn)率, 加上細胞對營養(yǎng)的利用并不*, 培養(yǎng)液中會殘留大量的蛋白, 造成提取純化的不便和培養(yǎng)基的浪費。所以, 在培養(yǎng)中調(diào)控動物細胞的代謝途徑一直較受重視。通過代謝調(diào)控, 可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生, 降低細胞的死亡速率, 還可以控制灌注速率和培養(yǎng)液成分, 控制細胞的狀態(tài)和比生長速率, 以提高目標蛋白的產(chǎn)率。具體有以下方法。
3. 1 控制葡萄糖濃度法
乳酸濃度升高,會導(dǎo)致比生長速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖 , 還可限制葡萄糖減少乳酸的生成, 使初始葡萄糖濃度較低, 在培養(yǎng)過程中再添加。在控制葡萄糖濃度法培養(yǎng)中, 生長期可以使葡萄糖濃度稍高, 以促進細胞生長; 在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度, 降低乳酸的產(chǎn)生速率, 避免乳酸的積累, 減少毒害, 降低死亡速率, 維護持活細胞數(shù)在較高水平。同時還可以降低比生長速率, 增加目標蛋白的產(chǎn)生速率。
灌注葡萄糖的同時, 要間歇或連續(xù)地加入其他組分, 以避免營養(yǎng)缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在較低水平, 因為細胞的生長不依賴糖酵解 , 即使沒有葡萄糖, 細胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。假如谷氨酰胺的濃度過高, 細胞就會偏向谷氨酰胺酵解, 從而削弱這種方法的效果。由于葡萄糖的價格相對低廉, 這種方法很有前途。
3. 2 控制谷氨酰胺法
上面提到, 沒有葡萄糖, 細胞可以利用谷氨酰胺作能量物質(zhì)。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 應(yīng)用這一方法的報道也較多?？刂乒劝滨０窛舛鹊哪康? 主要是減少氨的產(chǎn)生。氨對細胞的毒性比乳酸大得多, 表現(xiàn)為降低比生長速率, 增加死亡速率。有人詳細地研究了動物細胞的代謝過程, 采用底物限制補料分批工藝對動物細胞進行代謝控制。他采用這一方法, 使氨的濃度降低了一半。控制谷氨酰胺法與控制葡萄糖法一樣, 要維持葡萄糖在較低水平。
3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法
在細胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。葡萄糖消耗上升, 則谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相當(dāng)大的一個范圍內(nèi), 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比?？刂破咸烟呛凸劝滨０贩山档腿樗岷桶钡漠a(chǎn)生, 還能有效控制比生長速率。在細胞生長期, 提供充分的營養(yǎng), 供細胞的需要; 在產(chǎn)物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度或流量, 降低比生長速率, 增加目標蛋白的產(chǎn)率。
3. 4 代謝產(chǎn)物的去除
通常使用透析膜, 超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。有人建議加化學(xué)試劑比如鉀鹽來消除氨的影響 , 也有人建議可使用有谷氨酰胺合成酶的細胞。
灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在, 還有許多急待解決的問題。其zui大的缺點是培養(yǎng)基的利用不充分, 造成一定的浪費。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)品分離技術(shù)的進一步發(fā)展, 建立細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)（圖2） , 能充分利用培養(yǎng)液, 降低生產(chǎn)成本, 一直是人們追求的目標, 這里就不贅述。
細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)圖
三 . 動物細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)
動物細胞無血清培養(yǎng)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的重要研究課題之一。由于無血清培養(yǎng)基可以是*采用已知分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型組分的低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基。因而它不僅為研究和闡明細胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)機制提供了有力的工具，而且為現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是細胞工程的應(yīng)用準備了更好的條件。下面就動物細胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用現(xiàn)狀做一概述。
1 動物細胞培養(yǎng)基的發(fā)展過程：
（1）天然培養(yǎng)基階段
（2）合成培養(yǎng)基階段
（3）無血清培養(yǎng)階段
2 動物細胞培養(yǎng)中血清的作用和可能引發(fā)的問題
作用：
（1）提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細胞的毒性作用。（3）提供貼壁細胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴展因子。（4）提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。（5）提供 PH 緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH。（6）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。
可能引發(fā)的問題：
（1）在一些基礎(chǔ)研究中，往往影響實驗結(jié)果。
（2）血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物質(zhì)或抑制 物質(zhì)，對某些細胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。
（3）血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等細胞產(chǎn)品的分離純化帶來很大困難。
3 無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補充成分
（1）激素和生長因子
（2）結(jié)合蛋白
（3）貼壁因子和擴展因子
（4）低分子量營養(yǎng)因子
4 .無血清培養(yǎng)基的優(yōu)缺點及其應(yīng)用
優(yōu)點：
（1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性。
（2）避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。
（3）避免血清組分對實驗研究的影響。
（4）有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。
（5）可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化。
已應(yīng)用的領(lǐng)域有：
（1）研究細胞的分化條件
（2）用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究
（3）用于從多種細胞混雜的培養(yǎng)基中選擇目的細胞
（4）腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究
（5）用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品
缺點：組要表現(xiàn)為細胞的適用范圍窄，細胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。
四. 動物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器
細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是整個過程的關(guān)鍵設(shè)備,它要為細胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。按照動物細胞的生長要求, 具備低的剪切效應(yīng)、較好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)是這類反應(yīng)器設(shè)計或改進所必須遵循的原則。
1 攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式反應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力,它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性, 因此在生物反應(yīng)中被廣泛使用。但由于動物細胞沒有細胞壁的保護, 因此對剪切作用十分敏感,直接的機械攪拌很容易對其造成損害, 傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作動物細胞的培養(yǎng)顯然是不合適的。所以, 動物細胞培養(yǎng)中的攪拌式反應(yīng)器都是經(jīng)過改進的, 包括改進供氧方式、攪拌槳的形式及在反應(yīng)器內(nèi)加裝輔件等。
1. 1 供氧方式的改進
一般情況下, 攪拌式反應(yīng)器還常伴有鼓泡, 為細胞生長提供所需氧分。由于動物細胞對鼓泡的剪胞生長提供所需氧分。由于動物細胞對鼓泡的剪切也很敏感, 所以人們在供氧方式的改進上做了許多工作。
籠式供氧是攪拌式動物細胞反應(yīng)器供氧方式的一種, 即氣泡用絲網(wǎng)隔開, 不與細胞直接接觸。反應(yīng)器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力, 以滿足細胞生長的要求。北野昭一報道了一個經(jīng)過改進的攪拌式動物細胞反應(yīng)器, 整體呈梨形, 攪拌置于反應(yīng)器底部, 在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)內(nèi)側(cè)鼓泡, 絲網(wǎng)外側(cè)的細胞不與氣泡直接接觸。
1. 2 攪拌槳的改進
攪拌槳的形式對細胞生長的影響非常大, 這方面的改進主要考慮如何減小細胞所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進, 并在反應(yīng)器內(nèi)加裝了輔件, 實驗證明改進后的反應(yīng)器適用于對剪切力敏感的細胞進行高密度培養(yǎng)。反應(yīng)器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳, 頂部的法蘭蓋上安裝了3 塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為30°, 垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個反應(yīng)器維持了較小的剪切力, 實驗中用于昆蟲細胞的培養(yǎng), zui終的培養(yǎng)密度達到6 ×106 個/ mL , 成活率在98 %以上。
2 非攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式生物反應(yīng)器用于動物細胞培養(yǎng)存在的zui大缺點是剪切力大, 容易損傷細胞, 雖然經(jīng)過各種改進, 這個問題仍很難避免。相比之下, 非攪拌式反應(yīng)器產(chǎn)生的剪切力較小, 在動物細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強的優(yōu)勢。
2. 1 填充床反應(yīng)器
填充是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物, 供細胞貼壁生長。營養(yǎng)液通過循環(huán)灌流的方式提供, 并可在循環(huán)過程中不斷補充。細胞生長所需的氧分也可以在反應(yīng)器外通過循環(huán)的營養(yǎng)液攜帶, 因而不會有氣泡傷及細胞。這類反應(yīng)器剪切力小, 適合細胞高密度生長。
Park 等人在由填充床反應(yīng)器和外循環(huán)裝置構(gòu)成的連續(xù)流動的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)動物細胞。反應(yīng)器中的填料是帶有微孔的陶瓷珠粒, 細胞在微孔內(nèi)生長, 同時培養(yǎng)液也可以在孔內(nèi)擴散。實驗證明該反應(yīng)器適于動物細胞的高密度培養(yǎng), 細胞終期密度應(yīng)器適于動物細胞的高密度培養(yǎng), 細胞終期密度達到了5 ×108 個/ mL 。
2. 2 中空纖維反應(yīng)器
中空纖維反應(yīng)器 由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng)。這類反應(yīng)器由中空纖維管組成, 每根中空纖維管的內(nèi)徑約為200μm , 壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜, O2和CO2 等小分子可以自由透過膜擴散, 動物細胞貼附在中空纖維管外壁生長, 可以很方便地獲取氧分 。
John 等報道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的徑向流中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器內(nèi)有一個垂直的中央分配管, 外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床, 細胞在中空纖維外壁貼附并生長。空氣和CO2 的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層, 向細胞提供氧分并維持一定的pH值環(huán)境, 細胞的代射物隨氣流帶出。在這個反應(yīng)器中細胞生長的表面密度可達7. 3 ×106 個/ cm2 。
2. 3 氣升式生物反應(yīng)器
氣升式生物反應(yīng)器（airlift bioreactor） 也是實現(xiàn)動物細胞高密度培養(yǎng)的常用設(shè)備之一, 其特點是結(jié)構(gòu)簡單, 操作方便。
有人在氣升式反應(yīng)器中利用微載體培養(yǎng)技術(shù), 研究了Vero 細胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應(yīng)器中懸浮微載體培養(yǎng)Vero 細胞, 在加入適量保護劑、營養(yǎng)供應(yīng)充足的情況下,細胞可以正常生長至長滿微載體表面, 終密度可達1. 13 ×106 個/ mL 。
4 結(jié) 語
動物細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是細胞培養(yǎng)反應(yīng)器,主要解決的共性問題都是要按照動物細胞的生長要求, 使反應(yīng)器具備低的剪切效應(yīng)、良好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)。但在實際過程中, 這些原則總有一些相互制約的因素, 為了強化傳遞效果需要有一個充分的混合環(huán)境（包括氣體鼓泡） , 但動物細胞的脆弱性制約了這個環(huán)境的形成;為提高培養(yǎng)介質(zhì)中的溶氧度需要有較高的氧分壓,不過, 高的氧分壓也影響了代謝物的移出。同時,過高的氧分壓也影響細胞的正常生長。如何優(yōu)化這些制約, 是這類反應(yīng)器開發(fā)中要解決的問題。在動物細胞培養(yǎng)中, 反應(yīng)器的改進大多針對攪拌式反應(yīng)器。雖然這類反應(yīng)器剪切力大, 但由于它混合均勻、結(jié)構(gòu)簡單、操作方便以及良好的傳遞效果和操作彈性, 在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中仍占有重要的位置 。
目前, 研究工作要致力于開發(fā)高密度細胞培養(yǎng)反應(yīng)器, 提高細胞生產(chǎn)率或生物產(chǎn)物的濃度。尤其組織工程的迅速發(fā)展, 對動物細胞生物反應(yīng)器有了不同要求。要保持細胞離體培養(yǎng)時能具有同體內(nèi)一樣的三維異性結(jié)構(gòu)、維持分化細胞的功能并支持細胞的高密度生長 , 培養(yǎng)過程要考慮種植有細胞的三維基質(zhì)支架和生物反應(yīng)器所組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。事實上, 一種反應(yīng)器的開發(fā)不可能滿足動物細胞生長的所有要求, 同時也不可能適合所有的細胞培養(yǎng)方式。所以, 根據(jù)某種細胞的培養(yǎng)過程或細胞的某種培養(yǎng)方式, 開發(fā)反應(yīng)器也許會比通用反應(yīng)器有更好的效果。
五 其它方法：改變細胞特性
在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的初期, 細胞數(shù)量不斷增加, 表達重組蛋白的能力也在逐步提高L細胞表達隨細胞數(shù)量達到之后, 細胞數(shù)量和表達水平將下降L 因為用于生產(chǎn)具有重要醫(yī)用作用的生物活性蛋白的工程細胞, 其基因組普遍整合了病毒載體, 這就從根本上決定了細胞zui終命運是細胞凋亡L 目前已知參與細胞凋亡調(diào)控基因包括c2m yc、c2jun、bcl22、c2fo s、ras、p 53、bcl2x、bax 等,有些促進細胞凋亡, 有些抑制細胞凋亡L將抑制細胞凋亡的bcl22 基因?qū)爰毎? bcl22 基因的過量表達可抑制Gln 或缺氧引起的細胞凋亡, 減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗, 提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量L已證實bcl22 基因的過度表達可以提高灌流培養(yǎng)中雜交瘤細胞的活性和抗體的生產(chǎn)率.
六 結(jié) 語
一項新的細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟需要較長的時間。大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞是一項復(fù)雜而且經(jīng)驗性很強的工作L嚴格控制細胞培養(yǎng)的環(huán)境, 防止污染, 是進行大規(guī)模培養(yǎng)的前提L通過減少培養(yǎng)基中各種不利因素, 配置細胞生長的專一性無血清培養(yǎng)基, 以及選擇條件溫和、易操作、氣體交換速度快的生物反應(yīng)器和細胞生長的微載體,可提高細胞的活性和表達水平。
